新冠肺炎疫情發(fā)生以來(lái)，關(guān)于核酸檢測(cè)假陰性率過(guò)高的話題，一直是各方關(guān)注的焦點(diǎn)。有報(bào)道稱，以熒光定量RT-PCR作為檢測(cè)手段的新冠病毒檢測(cè)的陽(yáng)性率目前僅有30%—50%，導(dǎo)致奇高的假陰性率。
導(dǎo)致假陰性率發(fā)生的原因很多。2月22日，南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所發(fā)育生物學(xué)與遺傳學(xué)教授趙慶順接受科技日?qǐng)?bào)記者獨(dú)家采訪時(shí)指出，依據(jù)有關(guān)機(jī)構(gòu)發(fā)布的指南，核酸檢測(cè)前需將采集到的樣品進(jìn)行56℃滅活，這極有可能使新冠病毒核酸被降解，從而導(dǎo)致不能被正常檢出，最終提高了假陰性率。該研究成果《病毒核酸提取前的高溫滅活過(guò)程顯著降低可檢出病毒核酸模板量》，已在中國(guó)科學(xué)院科技論文平臺(tái)預(yù)發(fā)布。
56℃滅活可能導(dǎo)致病毒核酸被降解
2019新型冠狀病毒的遺傳物質(zhì)是單鏈RNA。因此，科研人員的目標(biāo)是在患者身上找到新冠病毒的RNA。這也是臨床診斷金標(biāo)準(zhǔn)。
目前，臨床檢測(cè)主要采用熒光定量RT-PCR試劑盒檢測(cè)。該方法是將標(biāo)本中的特定RNA序列逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)過(guò)30次以上擴(kuò)增后，病毒基因片段達(dá)到一定數(shù)量即可進(jìn)行可視檢測(cè)。
“理論上，哪怕模板只有1個(gè)病毒，就有可能被檢測(cè)出來(lái)。”趙慶順說(shuō)，科研實(shí)踐中，在模板(病毒)量大于100個(gè)的情況下，擴(kuò)增結(jié)果就會(huì)非常穩(wěn)定。
但是，趙慶順在網(wǎng)絡(luò)上看到一個(gè)教學(xué)視頻，不禁心生疑慮。該視頻由北京協(xié)和醫(yī)院和北京市衛(wèi)健委聯(lián)合制作。視頻3分08秒至3分40秒顯示：在制備核酸模板前，需將采集到的樣品在56℃條件下進(jìn)行30分鐘病毒滅活。
記者在中華醫(yī)學(xué)會(huì)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)分會(huì)發(fā)布的《2019新型冠狀病毒肺炎臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的生物安全防護(hù)指南(試行第一版)》中也看到：核酸擴(kuò)增前，可以對(duì)標(biāo)本先行消毒。包括56℃孵育30分鐘，加蛋白酶K。
中華醫(yī)學(xué)會(huì)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)分會(huì)發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎病毒核酸檢測(cè)專家共識(shí)》中，明確指出需將樣品56℃孵育至少45分鐘或更高溫度進(jìn)行滅活。
記者通過(guò)采訪確認(rèn)，絕大多數(shù)檢驗(yàn)醫(yī)師均按照上述規(guī)范，進(jìn)行56℃條件下時(shí)間不等的病毒滅活，然后才制備核酸模板。
這樣做帶來(lái)的問(wèn)題是，病毒RNA極易被核糖核酸酶降解，因?yàn)檫@種酶在60℃時(shí)活性最高。核糖核酸酶來(lái)自兩方面，一是樣本細(xì)胞內(nèi)，二是采集、保存、運(yùn)輸過(guò)程中的外來(lái)污染物。
進(jìn)行滅活處理是出于生物安全的考慮
“進(jìn)行滅活處理是出于生物安全的考慮，保護(hù)從事檢測(cè)的工作人員不被病毒感染。”趙慶順說(shuō)。
正是出于這方面的考慮，國(guó)家衛(wèi)健委發(fā)布的相關(guān)文件中，明確要求對(duì)標(biāo)本進(jìn)行滅活處理。
北京協(xié)和醫(yī)院制作的教學(xué)視頻以及中華醫(yī)學(xué)會(huì)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)分會(huì)發(fā)布的《防護(hù)指南》和《專家共識(shí)》，依據(jù)正是來(lái)自國(guó)家衛(wèi)健委相關(guān)文件，包括《新型冠狀病毒實(shí)驗(yàn)室生物安全指南(第二版)》《新型冠狀病毒肺炎實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)指南(第三版)》等。
但是，記者查詢了國(guó)家衛(wèi)健委相關(guān)文件，其對(duì)于病毒滅活的具體方法并未做出明確規(guī)定，只是籠統(tǒng)地要求：感染性材料或活病毒在采用可靠的方法滅活后進(jìn)行的核酸檢測(cè)。
趙慶順進(jìn)一步查閱了美國(guó)疾控中心、香港大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院以及華大基因發(fā)布的核酸檢測(cè)說(shuō)明，也未發(fā)現(xiàn)56℃滅活這一步驟。
病毒核酸降解對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響究竟有多大
記者在采訪中發(fā)現(xiàn)，不同人士對(duì)這個(gè)問(wèn)題的回答涇渭分明：
來(lái)自疾控部門、中國(guó)醫(yī)學(xué)會(huì)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)分會(huì)、相關(guān)醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)師的看法是，不會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果有太大的影響。而趙慶順等專家認(rèn)為，核酸提取前對(duì)人體樣品進(jìn)行高溫殺毒處理，可能是導(dǎo)致新冠病毒核酸檢出假陰性率過(guò)高的重要原因之一。
趙慶順以豬流行性腹瀉病毒(一種冠狀病毒，來(lái)自活疫苗)為模型開展了高溫滅活對(duì)病毒可檢出量影響的研究，結(jié)果表明：保存在普通等滲溶液(Hank’s液)中的樣品經(jīng)56℃孵育30分鐘，導(dǎo)致樣品中可檢出的冠狀病毒模板減少一半，如果以92℃孵育5分鐘，則可檢出的冠狀病毒模板損失96%以上。
“理論上，不排除新冠病毒的目標(biāo)RNA片段在56℃以上高溫滅活中不易被降解的可能。”趙慶順坦言，“但我寧愿自己的判斷是錯(cuò)的，也不希望因?yàn)槟硞€(gè)細(xì)節(jié)考慮不周而導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陰性。”
另外，不同品牌的樣品保存液，也會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生較大影響。趙慶順在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在56℃30分鐘條件下，采用南京諾唯贊研發(fā)的R503保存液存放豬流行性腹瀉病毒樣品時(shí)，病毒核酸的可檢出量是對(duì)照組(Hank’s液)檢出量的3倍；而如果是92℃5分鐘滅活，則檢出量是對(duì)照組的42倍。
中華醫(yī)學(xué)會(huì)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)分會(huì)主任委員王成彬教授在撰文回應(yīng)核酸檢測(cè)假陰性率較高現(xiàn)象時(shí)也指出，不同提取試劑對(duì)最后提取到的核酸數(shù)量和質(zhì)量可能存在差別，從而直接影響檢測(cè)結(jié)果。他建議，對(duì)于某些高度疑似病例，或檢測(cè)結(jié)果難以確定的病例，建議用2種以上試劑進(jìn)行檢測(cè)、驗(yàn)證。
“假陰性意味著漏檢，不僅會(huì)導(dǎo)致臨床中對(duì)疑似患者不能快速確診，而且會(huì)使漏檢者成為潛在的病毒傳染源。”趙慶順為此提出建議，一是盡量使用無(wú)核糖核酸酶污染的樣本采集管，二是將標(biāo)本放置在可保護(hù)病毒核酸免受高溫滅活損壞的樣品保存液中，從而確保樣品RNA從保存、運(yùn)輸?shù)礁邷販缁畹鹊玫饺瘫Ｗo(hù)，盡最大可能保證用于臨床檢測(cè)的核酸質(zhì)量，減少病毒核酸可檢出模板在核酸提取前的人為損壞。
